Khi Vương hậu của Vua Henry, Joan của Bồ Đào Nha đang mang thai công chúa Joanna la Beltraneja, Isabella và Alfonso được triệu về triều đình ở Segovia và chịu sự quản lý gay gắt của Henry cho tới khi hoàn tất việc học của cả hai. Trong khi Alfonso chịu sự quản lý của một gia sư trong khi Isabella trở thành Thị nữ trong đoàn tùy tùng của Vương hậu Joan. Vì vậy, cuộc sống của Isabella được cải thiện hơn so với tình trạng khó khăn nghèo nàn trước đây, bà không phải thiếu quần áo và thức ăn như khi còn sống ở Arévalo. Bà tiếp tục hoàn thiện các kỹ năng đọc, viết, lịch sử, âm nhạc, toán học và thần học. Hằng ngày, Isabella cùng các Thị nữ của mình học tập và trau dồi lòng mộ đạo, bà rất ít khi rời khỏi Segovia vì Vua anh Henry không cho phép.

Trước nguy cơ không có con trai thừa kế, các quý tộc Castilla lo lắng và ép buộc Vua Henry phải chỉ định người em trai khác mẹ Alfonso, cũng là em cùng mẹ của Isabella, được chỉ định làm Trữ quân. Tình hình kế vị này đã gây một sự khủng hoảng trong triều đình Vua Henry khi ấy, các lãnh chúa thậm chí còn lôi kéo, ép buộc Alfonso phải tự lập, dẫn đến Trận Olmedo thứ hai diễn ra vào năm 1467, giữa các lãnh chúa ủng hộ Alfonso với quân đội của Vua Henry. Kết quả của cuộc chiến này là sự nhượng bộ của Vua Henry, công nhận Alfonso là Trữ quân, đồng thời giao điều kiện Alfonso phải cưới con gái của ông là Joanna la Beltraneja, cũng là cháu gái của Alfonso và Isabella[2].

Năm 1468, tháng 7, chỉ vừa vài tháng sau khi được lập làm Trữ quân, Alfonso qua đời vì bệnh cảm. Phe lãnh chúa ủng hộ Alfonso nghi ngờ Trữ quân bị hạ độc, và họ lại khơi mào một cuộc chiến khác và đề nghị Isabella trở thành Trữ quân, bởi vì Isabella có tên trong hàng ngũ thừa kế trong di chúc sớm của Vua Henry. Isabella, thay vì công khai về phe nổi loạn, đã đến gặp Vua Henry tại Toros de Guisando, và ngay sau đó được chỉ định làm Trữ quân thay cho công chúa Joanna la Beltraneja. Theo nội dung đề nghị, Isabella không được phép kết hôn khi nhà vua chưa cho phép, và nhà vua cũng không được ép buộc bà kết hôn nếu bà không muốn.